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2 I N D I C E PAG. INTRODUCCION... "' OBJETIVOS MATERIAL Y METODOS RESULTADOS DISCUSION CONCLUSIONES SUMARIO BIBLIOGRAFIA... 45

3 I N T R O D U e e I O N La anatomía patológica recibió un impulso muy impo~ tan te con la aparición del microscopio, ya que se tuvo así la posibilidad de poder observar la constitución fina de los tejidos y órganos. Antony Van Leeuwenhock fue el primero en des cubrir el movimiento de la sangre, los eritrocitos;las fibras musculares y los espermatozoides, llamándosele por ésto Padre de la Anatomía Microscópic~ (14~.Afios más adelante ( ) un catedrático francés de nombre Marie Francois Xavier Bichat (Anatomista y Fisiólogo), fue el primero en trasladar al teji do la localización de todas las enfermedades sin llegar todavía a la célula. Y no fue hasta cuando Rudolf Vir-- chow dio un avance importante dentro de la anatomía patoló- - gica ya que buscó las causas y procesos patológicos en la uni dad viva, que conocía él entonces: la célula. La patología e~ lular significó una liberación del encierro en que se encon-- traba la filosofía natural y el vitalismo. A fines del siglo XIX, Wilhelm Schütz, discípulo de Virchow, comenzó a orientar y a organizar la anatomía patológica a la medicina veterina-- ria de acuerdo con principios científicos, fue el que introdg jo la histopatología como base auxiriar imprescindible en la ensefianza, en la investigación, y en el diagnóstico de las en fermedades de los animales,domésticos (14),(21). OfiCII'iA -.!t c::m~ Glf~tru;a

4 - 2 - En la medicina veterinaria moderna el valor de las pruebas del laboratorio resulta un auxiliar importante para - el diagnóstico definitivo de algunas enfermedades, que incluso adquieren mayor importancia, cuando los resultados se diri gen a alguna afección en especial. Así es un hecho que los - progresos en diagnóstico dentro de la medicina veterinaria, - posiblemente dependa por lo menos en buena parte, del uso de nuevos métodos de laboratorios. Uno de los principales métodos de laboratorio que resulta eficaz para llegar a un diag nóstico preciso, es la Histopatología, dicho método se basa - en la observación de las lesiones de tejidos alterados por al gún proceso morboso, desde el punto de vista microscópico. En la actualidad es muy importante recurrir a la - histopatología como medio auxiliar del diagnóstico ya que - - existen numerosas enfermedades que no pueden diagnosticarse - con seguridad sólo por medio de la interpretación de la histq ria clínica o de las lesiones macroscópicas observadas a la - necropsia, sino que en ocasiones es necesario conjuntar todo esto con un estudio histopatológico. En el laboratorio de Patología de la Facultad de M~ dicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Guadalaj~ ra, la técnica de tinción que usualmente se utiliza, es la de

5 - 3 - Hematoxilina y Eosina. Los tejidos teñidos con esta técnica, ~ se les alcanza a observar microscópicamente la localización, la forma y agrupamiento de sus células (su arquitectura celular), así como la determinación de algunas alteraciones patológicas no específicas que se pueden presentar en un sinnú- - mero de afecciones y ésto nos puede confundir el diagnóstico final. Es por eso que se plantea la aplicación de técnicas especiales en el uso cotidiano del laboratorio para que se -- realicen los diagnósticos más precisos y específicos. Las técnicas que se proponen son: A) METODO DE SUDAN IV: Técnica de tinción para la - d~erminación de grasas neutras. B) METODO METACROMATICO DE KELLY: Técnica de tin- - ción específica para hongos. C) METODO DE SHORR Y HEMATOLIXINA: Técnica de tin-- ción especial para la determinación de Cuerpos - de Inclusión. D) METODO DE SCHLEIFSTEIN: Técnica específica para la determinación de Corpusculos de Negri. ~~IU \it! rjlt _,. _ ;:u: ::~f:"~r9~

6 - 4 - La Degeneración Grasa, es la presencia anormal de - grasa visible en la célula. Casi todas las células en proceso de degeneración contienen glóbulos lipídicos en la matriz citoplasmática y aunque esto puede considerarse degeneración grasa, el término se aplica constantemente a acumulaciones ma sivas que deforman la célula, se observa comunmente degeneración grasa en células que normalmente no metabolizan los lí- pidos, es decir el hígado, riñón, el corazón (21). La Degeneración Grasa, es causada por una gran va- riedad de factores etiológicos. Una cantidad inadecuada de oxígeno es causa frecuente de esta afección y ocurre en la anemia, ya que no existe un aporte adecuado de hemoglobina y no son transportadas cantidas adecuadas de oxígeno a los teji dos. esta puede ser causada por hemorragias severas,parásitos hematófagos, protozooarios hernáticos y hemolisis. La degener~ ción grasa también está asociada con diferentes trastornos circulatorios como son las hiperrnias pasivas y crónicas, o is quernias, estas obstaculizan el transporte de oxígeno a la célula. Otras etiologías, causantes de esta alteración son las substancias químicas orgánicas e inorgánicas. Existe un - buen n~mero de toxinas bacterianas y micóticas que son capa- ces de causar una degeneración grasa, corno son las salrnonelo-

7 o sis e infecciones por aflatoxinas. Hay un gran número de vene nos químicos como son el cloroformo, tetracloruro de carbono y tetracloroetileno que producen este cambio, numerosas substancias inorgánicas como es el fósforo, plomo y arsénico, así como la intoxicación por ~lantas como el Senecio, Astragalus y Crotalaria causan degeneración grasa. Y por último la degeneración grasa también está asq ciada con alteraciones metabólicas como es la diabetes y la - acetonemia (21). Los órganos afectados por este proceso son blandos, poco consistentes, friables y con un color amarillo abigarrado (8). Microscópicamente el cambio básico es la aparición de gotas de grasa de tamaño variable en el citoplasma de la cé- lula (19). Como las grasas son solubles en el alcohol y xileno no aparecen en los materiales incluidos en parafina con las - técnicas habituales y en la célula se observan imágenes negativas, por lo consiguiente es necesario realizar los cortes - en microtomo de congelación {21). La célula que ha experimentado degeneracióngrasase tiñe pobremente con la técnica de Hematoxilina y Eosina. Las

8 - 6 - estructuras celulares no son distinguibles y los núcleos se - tiñen menos, además que se puede confundir con otro tipo de - degeneraciones, como son la hidrópica, causada por un aumento del volumen celular generada por un exceso de agua intracelular, o por una degeneración turbia o nebulosa que es también un aumento del volumen celular pero causada por una altera- - ción del metabolismo protéico. El implementar la técnica de - Sudan IV nos será de mucha utilidad en los casos de una degeneración grasa inicial que es la que más podría confundirse con una degeneración hidrópica o una degeneraciín turbia. La técnica de Sudan IV es considerada como una de - las mejores para la determinación de lípidos, las grasas que se encuentran en los tejidos teñidos por este método se obser van de color anaranjado o rojo. Considero que la utilización de esta técnica nos da rá un enfoque directo y preciso para poder determinar una degeneración grasa y así llegar con más precisión a un buen diagnóstico (15},(20),(21). El avance que ha experimentado la micología en los últimos años, es debido al desarrollo de una mejor tecnología dentro de la Medicina Veterinaria, así como también a la creciente difusión alcanzada por las micosis del hombre y

9 - 7 - de los animales. Sin embargo los conocimientos que se tienen sobre una serie de enfermedades de los animales domésticos - son todavía muy incompletos, la importancia de las enfermedades ocasionadas por los hongos en los animales domésticos derivan principalmente de el bajo rendimiento corporal que originan y del perligro que para la salud humana constituyen las micosis. Bajo el concepto de micosis se incluyen las enferme dades causadas por diversas especies de hongos (17). Los hongos son organismos vegetales que no contie- nen clorofila; se llaman heterótrofos porque tienen que ali- mentarse de otros, ya que necesitan para su alimentación sub~ tancias orgánicas ya elaboradas por otros que sean autotrofo& Son vegetativos, pero no tienen tallo, raíces, hojas, ni flores, su cuerpo se llama talo, que puede ser unicelul~r o pluricelular con estructura completa, formada por membrana, protoplasma y núcleo figurado. Se desarrollan por micelos o hi- fas, que forman una trama o tejido y cada filamento recibe el nombre de hifa y toda la trauma recibe el nombre de micelo que es siempre pluricelulado. La clasificación de los hongos se basa en la produ~ ción de esporas y conidiósporas, así como en las caracterí~-~~~- JfiUIWA <J&:

10 - 8 - ticas morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de sus estructuras. De acuerdo con la localización de los hongos pará- sitos en el organismo hospedador, se distinguen en micosis ex ternas o dermatomicosis y en micosis internas o micosis de los sistemas corporales (10-13). A continuación explicaremos algunas de las princip~ les micosis que afectan a los animales domésticos, así como - las principales lesiones o alteraciones que causan los mis- - mos: A).- DERMATOMICOSIS O MICOSIS EXTERNAS.- Se refiere a las infecciones micóticas que afectan al pelo, las uñas, el estrato córneo, así como los tejidos subcutáneos. 1.- MICROSPORIDIOSIS: Este tipo de hongos pertenecen a los - llamados hongos ''Geofílicos" u hongos del suelo, afectan principalmente a caninos, felinos y suinos ocasionándoles lesiones circulares caracterizados por la pérdida de pe- lo, pelos rotos cubiertos por escamas y costras especialmente en los bordes de la lesión, así como la de decolora ción de la piel en las lesiones circulares. 2.- TRYCOPHITOSIS: Hongos que nos producen la tiña en el bovi

11 - 9 - no y el equino, tienen afinidad por la queratina y poseen la cualidad de producir en el pelo, órganos perforadores para introducirse en el interior adelgazando cierta parte de la piel, esta zona se distingue por las lesiones circ~ lares o de forma irregular, caracterizadas por la pérdida de pelo costras gruesas de color gris. 3.- CANDIDIASIS: Las especies del género cándida, viven como saprófitos en el intestino, boca y vagina de algunas esp~ cies, principalmente en el humano, son saprófitos también del suelo y algunos alimentos como son el queso, las frutas, los cereales, las legumbres, etc. Se caracterizan -- porque afectan a todas las especies, ocasionándoles pla-- cas blancas y gruesas así como maceración de la piel en - las uniones mucocutáneas, como son la vulva, oído, ano, orificios nasales. 4.- ESPOROTRICOSIS: Hongos que lesionan principalmente al tejido subcutáneo y linfático, existiendo la formación de - nódulos y granulomas esféricos duros, en el sitio de la - herida o por punción del tejido tegumentario (forma de -- transmisión). Los nódulos se ulceran y drenan.en los equi nos también se forman nódulos pudiéndose desarrollar largo de los vasos linfáticos. JFH..l\'OA. n:. ~~~~1'.1 c.:t,:~n~

12 RINOSPORIDOSIS: Hongos que causan una infección crónica - de las mucosas de la cavidad nasal, caracterizada por polipes que en raras ocasiones alcanzan de 2 a 3 cm.,afecta principalmente a los equinos y los bovinos. 6.- FICOMICOSIS: Afecta a todas las especies, en especial a - los felinos y equinos, se caracteriza por una inflamación proliferativa y crónica de la piel, así como de las mem-- branas mucosas, en el equino, existe la presencia de granulomas no mayores de 1 a 3 cm., en la cavidad nasal. y en los belfos (4), (lo), (13), (17). B) MICOSIS GENERALIZADAS: Aunque estos organismos - por lo general afectan a órganos internos, también pueden pr2 ducir alteraciones en la piel. 1.- MUCORMUCOSIS: este tipo de afección es muy rara, presenta lesiones de -tipo granulomatosa en ganglios linfáticos. En bovinos en gestación puede causar problemas de placenti-- tis, determinando aborto y necrosis de los contiledones - maternos, el material necrótico es de tipo adherente y da a los cotiledones placentarios el aspecto de estructuras de tipo acojinado amarillentos y blandos, el viene entre el tercero y el séptimo mes de gestación. OFIOI\iA t.l!:: U?Il~ CifCJT~~

13 ASPERGILOSIS: Los aspergillus se encuentran en el aire,la tierra, en los productos orgánicos y en muchos órgapos CQ mo saprófitos, pasando a patógenos en determinadas condiciones, no son capaces de atacar un órgano sano, pero sí de desarrollarse en un órgano enfermo produciendo una infección secundaria, afectan principalmente a las aves y - bovinos, causando una invasión del tracto digestivo y res piratorio, con presencia de nódulos, necrosis y ulceraciq nes a todo lo l~rgo de las mucosa~. En bovinos puede exis tir además, alteraciones en la piel con aparición de granulomas micóticos. 3.- HISTOPLASMOSIS: Este tipo de hongos afecta principalmente el sistema retículo endotelial, 9ue tiene la misión de de fensa, causando una baja en el sistema inmune, lo cual se complica con un sinnúmero de afecciones secundarias, se - encuentra en forma saprofítica en el excremento de murci~ lago, su puerta de entrada es el sistema respiratorio, e intestino, causando lesiones ulcerosas o focos necróticos gaseosos en pulmón, ganglios mediastínicos, ganglios bron quiales, médula ósea, bazo, hígado y riñón. 4.- ACTINOMICOSIS: Los actinomices viven en los animales y v~ getales en forma saprofítica, y cuando se vuelven pató- - genos producen tumoraciones que después supuran comunican

14 do al exterior por trayectos fistulosos. Afectan a todas las especies, siendo más común en los bovinos, las lesiones características se presentan en la mandíbula, produ-- ciendo una osteitis supurativa (llamada mandíbula hinchada) y en muchos casos hay una producción considerable de tejido conectivo en los tejidos subcutáneos adyacentes existiendo descargas de un exudado purulento, grueso y amarillento. 5.- CRIPTOCOCOSIS: Problema que afecta principalmente a los - equinos causando granulomas nasales y labiales,con preseg cia de lesiones mixomatosas, que se infiltran al organismo causando abscesos pulmonares. 6.- COCCIDIOMICOSIS: Hongos que lesionan príncipalmente al -- pulmón, bazo, hígado, ganglios mediastínicos y branquia-- les, existiendo la presencia de lesiones granulomatosa con contenido purulento de color crema. 7.- BLASTOMICOSIS: Hongos saprofíticos de la materia orgánica en descomposición, producen una infección supurativa granulomatosa crónica en la piel, con presencia de nódulos - ulcerados subcutáneos, existiendo metastasis a

15 NOCARDIASIS: Actúan principalmente en los canideos y feli ; nos ocasionado nódulos cutáneos y subcutáneos, pudiendo existir nódulos pulmonares con presencia de piotorax (4), (lo), (13), (17). Obtener conclusiones sobre la especie de hongos actuantes, tomando como base el cuadro clínico, es sólo posible dentro de ciertos límites, ya se sabe que el mismo hongo puede dar diferentes formas clínicas de la enfermedad y que el - mismo cuadro puede ser causado por diversas afecciones. Por otra parte la designación de las micosis de - - acuerdo con directrices puramente botánicas resuelta de valor escaso para el médico veterinario, puesto que entonces no se define con precisión las alteraciones patológicas típicas (18). Aun en la observación macroscópica de las lesiones causadas - por hongos nos sería difícil dar un diagnóstico ya que éstas se pueden confundir con diversas alteraciones patológicas - - (neoplasias, quistes, abscesos, inflamaciones, lesiones gran~ loma tosas, etc.) o con una gran var.iedad de problemas que - - afectan la piel (13). Cuando se aplica la técnica de hematoxilina y na a tejidos afectados por hongos, las estructuras micóticas OfiUI\iA l..l.kt t/l!.'bm>ill Clfl~...:!J

16 se pierden ya que se tiñen al igual que el citoplasma de las células y lo único que se observa al microscopio es una man-- cha de color rosa infiltrada entre los tejidos, lo que impedi ría precisar si se trata de un hongo o alguna otra estructura Al montar la técnica Metacromática de Kelly, especi fica para hongos, en el uso habitual del laboratorio, será de mucha utilidad para descartar las afecciones que se nos po- - drían confundir, además de que dicha técnica, tiñe los hongos a la perfección, pudiendo observar así la localización y forma de los mismos (12). Los virus constituyen en grupo de agentes infecciosos caracterizados por su tamaño pequeño y su parasitismo - - obligado, se hallan ampliamente distribuidos en la naturaleza y solamente se propagan en la c~lula viva de plantas,animales o bacterias. Muchas de las enfermedades infecciosas de los -- animales y el hombre son producidas por virus (16). Una característica exclusiva de ciertas virosis es la formación de cuerpos de inclusión. Durante la replicación de los virus en.el interior de las células se pueden producir estructuras anormales específicas, éstas estructuras son llamados cuerpos de inclusión. ~ ;..Jr~A <Jk -.; u~ CIEDV~

17 Dichos cuerpos pueden llegar a ser mucho más gran-- des que las partículas virales, éstas no son mayores que los nucleolos, y pueden localizarse ya sea en el núcelo, en el ci toplasma o en ambos. Para muchas infecciones virales se cree que tales cuerpos están en el proceso del desarrollo del vi- rus. En algunas infecciones el cuerpo de inclusión puede es-- tar formado por una masa de partículas virales, ya que dichas partículas alcanzan una madurez exacta dentro del mismo, y CQ mo último caso el cuerpo de inclusión parece ser un vestigio de ia replicación viral (11),(15). Los Corpdsculos de Negrison inclusiones eosinofílicas citoplasmáticas, consecuencia - de la alteración del metabolismo celular, causado por la inv~ sión viral, éstos cuerpos de inclusión son característicos de la Rabia (15). La presencia de cuerpos de inclusión pueden ser cog siderable utilidad en el diagnóstico de algunas enfermedades infecciosas, es por lo cual se explicarán algunas de las prig cipales afecciones virales que producen cuerpos de inclusión, así como la localización de los mismos: 1.- LARINGO TRAQUEITIS AVIAR: Es una afección causada por un herpes virus, en el cual los a localizar en el epitelio que recubre la r'. ~ cjt " 'Jclh,_no-n.-

18 van a ser de tipo intranuclear. 2.- HEPATITIS (aves y caninos): Los cuerpos de inclusión deéste tipo de problema que es causado por un adenovirus, - los vamos a encontrar en el endotelio vascular y a nivel de las células hepáticas, estos cuerpos de inclusión van a ser también de_tipo intranuclear. 3.- MOQUILLO CANINO: Es causada por un mixovirus y los cuer- pos de inclusión los vamos a localizar en las células epi teliales de la vejiga, riñón, conductos biliares, cerebro (células de la Neuroglía),epitelio lingual y conjuntival, conjuntival, cojinete plantar, estómago, intestino y pueden ser citoplasmáticos e intranucleares. 4.- PANLEUCOPENIA FELINA: Es una afección que ataca principal mente a los gatos, existe la presencia de los cuerpos de inclusión en los epitelios de la mucosa intestinal, hígado, riñón y ganglios linfáticos. 5.- ENFERMEDAD DE AUJESZKY: En esta afección pueden existir - ocasionalmente inclusiones eosinofílicas intracelulares - en las células de la glía o en las neuronas, raras veces son observadas en bovinos,y en cerdos nunca se

19 JHUM!.lt,< >'~MJ C:IHJBI>Mo/\ GASTROENTERITIS TRANSMISIBLE: Causada por un parvovirus, ~ en la cual las inclusiones de tipo intranuclear o cito- - plásmico, se localizan en las células de las criptas a ni vel de vellosidades intestinales y músculo cardíaco. 7.- VIRUELA: Este problema afecta a todas las especies,es cau sado por un paramixovirus y los cuerpos de inclusión se - observan en todas las capas de la epidermis. 8.- RINONEUMONITIS VIRAL EQUINA: Ocasionada por un herpes vivirus, en la cual las inclusiones van a hacer de tipo intranuclear,y se van a localizar en las células hepáticas, en el epitelio bronquial y bronquialveolar, membrana.nictitante y epitelio lingual (4),(6),(11),(12),(16). La presencia de cuerpos de inclusión puede ser de - considerable utilidad en el diagnóstico de algunas enfermedades de origen viral. El empleo de la técnica de Hematoxilina y Eosina,en muchas ocasiones no puede teñir bien los cuerpos de inclusión y en ocasiones pasan desapercibidos, además que se pueden co~ fundir con alguna otra estructura celular, como es el lo.

20 Es por eso que creo necesario implementar una téc- nica especial para estas inclusiones, como es la de Shorr Y - Hematoxilina. La Rabia es una enfermedad infecciosa causada por - un rabdovirus, en la cual existen pequeños cuerpos de inclu- sión, que van a estar localizados en el citoplasma de las células nerviosas. Negri, en 1903 descubre estas pequeñas estructuras en las células nerviosas del asta de ammon y pensó que había descubierto un microorganismo que debía de incluirse dentro - de los protozoos, estos tipos de estructuras se apreciaban - principalmente dentro del citoplasma de ias células de teji- dos nerviosos de animales y humanos que habían muerto a causa de una infección rábica. Estos corpúsculos presentaban diversos tamaños, desde 1 hasta 10 ó 15, incluso mayores, hasta 27 m. y en una sola célula puede existir de 1 a 6 de estas es tructuras. EN 1906, Babes confirma la presencia de cuerpos de negri en la rabia, y los describe como un resultado de una -- reacción de la infección y no como parásitos, utilizando la - presencia de éstos como una prueba diagnóstica práctica para los animales rabiosos y sentó las bases para el diagnóstico OfiCii\iA l.lt

21 de la misma (3). La rabia por ser una enfermedad de importancia en - salud pública, requiere llevar a cabo un diagnóstico preciso, y los tejidos del S.N.C. afectados por éste problema, teñidos con la técnica de Hematoxilina y Eosina no nos remarca en sí la afección, ya que las lesiones que se alcanzan a observar - como es la degeneración o la infiltración linfocitaria, se p~ dría confundir con una encefalitis de otro tipo,que puede ser causada por diferentes etiologías, además los corpúsculos de Negri se pueden confundir con alguna otra estructura citopla~ mática, es por~llo que se propone emplear una técnica desa-- rrollada específicamente para cuerpos de Negri, dicho método de tinción es el de Schliefstein (3),(13),(22). El propósito de montar esta serie de técnicas en el uso cotidiano del laboratorio, es porque permitirá obtener fá cilmente resultados en un tiempo más reducido, asimismo para confirmar el resultado de algún otro diagnóstiéo, dado por la Facultad o por alguna otra Institución, además que ayudará a- descartar diversas afecciones que en la actualidad pueden cau sar confusión. OFICII\iA ut ~ ('JFfuHS::IJ';

22 O B J E T I V O S OBJETIVO GENERAL: Montar y estandarizar nuevas técnicas de tinción en el laboratorio de Patología, para la realización de diagnósticos más precisos y dejar colecciones de laminillas para que se puedan utilizar en las prácticas de Pa tología. OBJETIVOS PARTICULARES: - Estandarizar nuevas técnicas de tinción para el diagnóstico preciso de algún problema patológico. - Implementar al laboratorio de Patología, de reactivos, mat~ riales y preparaciones necesarias para las nuevas técnicas de tinción propuestas a fin de que en cualquier momento pu~ dan ser utilizadas. OfiCif\IA di '}~JS.~ QEIIIYIJ

23 MATERIAL Y METODOS El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Patología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Guadalajara, y se utilizaron órganos so~ pechosos de Degeneración Grasa, Micosis y enfermedades vira- les que determinan la formación de Cuerpos de Inclusión.Estos órganos se obtuvieron de los animales que fueron remitidos al departamento para su diagnóstico en donde se les aplicó la técnica correspondiente. I.- METODO DE SUDAN IV. INDICACIONES: - Técnica de tinción para la determinación de Gra- sas Neutras (Degeneración Grasa). FIJACION: - Formol al 10% SOLUCION: - Alcohol de 70 C. - Acetona - Sudan IV 55 ce. 50 ce. A saturación PROCEDIMIENTO: - Hacer cortes del tejido por medio del microtomo - de congelación.

24 Teñir con hematoxilina de Harris, durante 15 min. - Lavar con agua destilada. - Virar con agua de la llave. - Sumergir los cortes en Sudan IV durante 10 min. - Lavar con agua destilada. - Montar las piezas en glicerina. RESULTADOS: Los lípidos infiltrados en el tejido se observan de color anaranjado a rojo. II.- METODO METACROMATICO DE KELLY. INDICACIONES: - Método específico para la determinación de Hongo& FIJACION: - Formol al 10% SOLUCIONES: Reactivo Sulfatoso: - Añadir poco a poco ácido sulfúrico concentrado a un volumen igual de eter anhidro helado. AZUL DE TOLUIDINA: - Azul de Toluidina O (C.I ).01 g. - Acido Acético al 3 % loo. O ml.

25 PROCEDIMIENTO: RESULTADOS: - Desparafinar los cortes y pasarlos al alcohol etí lico absoluto. Sacar los cortes en el aire de 5 a 10 minutos. - Sumergirlo al reactivo sulfatoso 5 minutos. ' - Lavar en ácido acético 1 minuto, cambiar la solución después de 10 deslizamientos. - Teñir con Azul de Toluidina por 5 minutos. - Lavar en ácido acetico al 3% por un minuto. - Deshidratar en alcohol etílico absoluto 1 minuto. - Limpiar y montar. - Hongos.- Rojo a Violáceo. -Fondo.- Azul Claro (12). III.- METODO DE SHORR Y HEMATOXILINA INDICACIONES: - Técnica de tinción para Cuerpos de Inclusión. FIJACION: - Formol al 10% SOLUCIONES: ALCOHOL ACIDO AL 1% - Acido clorhídrico concentrado 1 ml. - Alcohol etílico 99 ml. OflCII\IA ~ 1~l'llilfu CIEh~

26 SOLUCION DE SHORR - Alcohol etílico 50% ml. - Escarlata Biebrich, soluble en agua gm. - Naranja G gm. - Verde FCF gm. - Acido fosfotusico gm. - Acido fosfomolitico mg. - Acido acético glacial m l. Mezclar y no usar hasta que todos los ingrediéntes estén completamente disueltos. PROCEDIMIENTO: Desparafinar las secciones de manera usual y llevarlas al agua. - Teñir con Hematoxilina de Harris: 3-5 minutos. - Lavar en agua y diferencias en alcohol ácido al - 1%, hasta que no haya Hematoxilina en el citopla~ ma de las células. Corroborar al microscopio la - tinción. - Lavar con agua e introducir las secciones en carbonato de Litio, hasta que los tejidos tomen un - color azuloso. - Lavar en agua corriente durante 10 minutos. - Colocar las secciones en el colorante de Shorr du rante 3 minutos.

27 RESULTADOS: Lavar en alcohol al 95%, y corroborar en el mi- - croscopio que el tejido conectivo esté de un co-- lor verde claro. - Lavar varias veces en alcohol absoluto y aclarar, en cambios de 2 a 3, en el Xilol y por último mon tar en resina. Cuerpos de Inclusión - Rojo Brillante Tejido Conectivo - Verde Brillante Fibras Elásticas - Rojo PÚrpura Núcleo - Azul Músculo - Rojo Queratina - Naranja Eritrocitos - De naranja a rojo (12) IV.- METODOS DE SCHLEIFSTEIN INDICACIONES: - Método para la determinación de corpúsculos de Ne gri. FIJACION: SOLUCION ZENKER. Dicromato de Potasio Bicloruro de Mercurio Sulfato de Sodio 2.5 grs. 5.0 grs. 1.0 grs. ()ficiiva ~.!t. fr:f!a.' f'j ClflU~

28 Acido Acético Glacial Agua destilada 5.0 ce. loo ce. Fijar durante 24 hrs. SOLUCION: - Fucsina Básica (C.I ) - Azul de Metilo (C.I ) - Glicerina Alcohol Metílico 1.8 gm. 1.0 gm ml ml. Para su uso agregar lo gotas de la solución a ml. de Hidróxido de Potasio. El Hidróxido de Potasio de be de estar diluido en agua (lgr/40,000 ml.de agua destilada) Se puede utilizar también agua alcalina corriente y ésta se - conserva por tiempo indefinido. PROCEDIMIENTO: Desparafinar e introducir las secciones en una so lución de 100 ml. de alcohol al 80% más ~gr.de Iodo, durante 5-10 minutos. - Lavar con agua corriente e introducir los tejidos en una solución de Hiposulfito d Sodio al 5% du-- rante 5 min. - Lavar con agua corriente e introducir los tejidos en un recipiente y cubrirlo ampliamente con la tinción (preparada).

29 Calentarlo en la estufa Bacteriológica durante 15 minutos a una temperatura de 80 C. Sin dejar que la solución hierva. - Enfriar y enjuagar con agua. - Decolorar y diferenciar cada deslizamiento o pa-- ses por agitación en alcohol etílico al 90%, hasta que los cortes tomen un color violeta pálido. - Aclarar y montar. RESULTADOS: - Cuerpos de Negri - Rojo magenta profundo. - Inclusiones Granula- - Azul fuerte u obscuro. res - Nucleolo - Negro azuloso. - Citoplasma - Eritrocitos - Azul violeta -Color cobre (12). JfiUM \.lt t!j"il. b.l Glff:a~

30 R E S U L T A D O S Al realizar las técnicas de tinción propuestas se - obtuvieron los resultados, esperados para cada una de ellas. Se realizaron colecciones de tejido de algunos órganos que -- fueron dados como positivos en la técnica de Hematoxilina y - Eosina,. con el fin de comprobar la eficiencia de dichas técnicas. A continuación, se describen los órganos y técnicas que se utilizaron, remarcando principalmente la afección, así corno algunas características resultantes de la aplicación de la técnica. ihum ut CIHUR\ "'J.';'-:U1~

31 I.- METODO DE SUDAN IV Técnica de tinción para la determinación de Grasas Neutras (Degeneración Grasa). ESPECIE AFECCION ORGANO TECNICA TECNICA DE RESULTADOS H y E SUDAN IV AVE SALMONELOSIS HIGADO POSITIVO POSITIVO Vacuolas en el citoplasma de los hepatocitos de color rojo brillante. CANINO TOXEMIA PARA HIGADO POSITIVO POSITIVO Presencia de pequeñas va- SÍTARÍA cuelas de color rojo en - el citoplasma de los hep~ tecitos en gran cantidad. FELINO PROBLEMA DE HIGADO POSITIVO NEGATIVO NO SE OBSERVA - ORIGEN METABO LICO BOVINO ENTERITIS LIN HIGADO POSITIVO NEGATIVO NO SE OBSERVA FOCITARIA(PRQ BABLEMENTE DE ORIGEN VIRAL). OVINO INTOXICACION HIGADO POSITIVO NEGATIVO Pequeñas vacuolas en los hepatocitos destribuidas principalmente en la zona centrolobulillar. ~ ~e \5:::!:! 2FQ o~ n't ~w ~ N 1..0

32 La presenci~ de vacuolas de color rojo en el cito- plasma de los hepatocitos nos indica que existe grasa no met~ bolizable por la misma célula, causándole así una degenera- - ción. Los órganos que resultaron negativos a la prueba de Sudan IV, nos representan tal vez una degeneración de otro tipo que pudimos confundirla, al observarla con la técnica de Hem~ toxilina y Eosina. De los casos que se pusieron a prueba se tomaron - también muestras de tejidos de corazón y riñón (órganos que - nos presentan también la degeneración grasa) para la aplica- ción de las técnicas resultando éstas totalmente negativas, - aun en la técnica de Hematoxilina y Eosina. ufi(.im Dt ~~CIE~T~

33 II.- METODO METACROMATICO DE KELLY Técnica de tinción específica para Hongos ESPECIE ORGANO TECNICA H y E METODO METACRO MÁTICO DE KELLY RESULTADOS EQUINO PIEL DELGADA POSITIVO POSITIVO Hongos amorfos que se encuentran en - mayor cantidad en la epidermis,y la - dermis se encuentra ligeramente invadida. EQUINO PIEL DELGADA POSITIVO POSITIVO Se encuentran los Hongos en forma filamentosa invadiendo las células epiteliales de la dermis encontrándose en mayor cantidad alrededor de los f2 lículos pilosos. CANINO PIEL DELGADA POSITIVO POSITIVO Son Hongos circulares y semicircula-- res que invaden superficialmente la - epidermis,algunos traspasan la lámina propia. AVE PROVEN- TRI CULO POSITIVO POSITIVO Los Hongos invaden el epitelio,lámina propia y algunas porciones de la zona glandular observándose en forma de ra mificaciones. ~~ n?. ;:;:: 7> W'... c. ::;;; ~ ' w... -~-~

34 Los resultados obtenidos con la aplicación de esta técnica rematcan en sí la afirmación de los que se habían dado como positivos con la aplicación de la técnica usual, ésto da además la certeza de que en realidad se trata de un probl~ ma de tipo Micótico. Los hongos se tiñeron de un color violáceo obscuro, teniendo como contraste un azul claro, que es el color que to maron las demás estructuras del tejido. OfiUI\iA cjt ~G/fflir~

35 III.- METODO DE SHORR Y HEMATOXILINA Técnica de tinción específica para la determinación de CUERPOS DE INCLUSION. ESPECIE AFECCION ORGANO TECNICA H y E TECNICA DE SHORR y H. RESULTADOS CANINA HEPATITIS HIGADO POSITIVO POSITIVO Los Cuerpos de Inclusión son de tipo intranuclear y se observan en los Hepatocitos. PARVOVIRO SIS INTESTINO DELGADO POSITIVO POSITIVO Los Cuerpos de Inclusión se encuentran en los enterocitos, son de tipo - intranuclear y van de 1 a 4. ESTOMAGO POSITIVO POSITIVO Los Cuerpos de Inclusión se encuentran en las células principales del es tómago, son de tipo in-= tranuclear y citoplásmicos, van de 1 a 3 CORAZON NEGATIVO NEGATIVO NO SE OBSERVAN MOQUILLO PULMON POSITIVO POSITIVO Cuerpos de Inclusión citoplásmicos en el epitelio bronquialveolar. ~ ~~ tll'q Gi ~ CEREBRO NEGATIVO NEGATIVO No se observan,el núcleo se tiñe igual que los Cuerpos de Inclusión..l. w

36 Método de Shorr y Hematoxilina (Continúa... ) ESPECIE AFECCION ORGANO - TECNICA H y E TECNICA DE SHORR y H. RESULTADOS CANINO MOQUILLO (continúa) VEJIGA NEGATIVO POSITIVO Cuerpos intranucleares en el epitelio de transición. ESTOMAGO NEGATIVO POSITIVO Son intranucleares y citoplasmáticos, se encuentran en el epitelio de la zona glandular siendo de tamaño pequeño. HIGADO NEGATIVO NEGATIVO NO SE OBSERVAN RINON NEGATIVO NEGATIVO NO SE OBSERVAN COJINETE PLANTAR POSITIVO POSITIVO Los Cuerpos de Inclusión - se observan en el epitelio papilar siendo de tipo intranuclear y citoplásmico. IMPRONTA OCULAR NEGATIVO NEGATIVO NO SE OBSERVAN AVE LARINGOTRA QUEITIS. TRAQUEA POSITIVO NEGATIVO NO SE OBSERVAN FELINO PANLEUCOPE NIA INTESTINO POSITIVO POSITIVO Los cuerpos de Inclusión - se observan de tipo intranuclear en el epitelio de las vellocidades intestina les. SUINO VIRUELA PIEL DEL- POSITIVO POSITIVO GADA Son cuerpos de Inclusión - intranuclear que van de l a 2 y se encuentran en el epitelio de la epidermis. w ~

37 Para la realización de esta prueba se tomaron los - casos sospechosos, en base a la historia clínica y en base a los resultados dados por el estudio histopatológico. Se llevó a cabo la prueba en órganos que según la literatura presentan Cuerpos de Inclusión, pero algunos resultados totalmente neg~ tivos, ésto nos indica que los Cuerpos de Inclusión son repr~ sentativos de cierta etapa de la enfermedad (13}. Los Cuerpos de Inclusión observados después de la - aplicación de esta técnica se ven de un color rojo diferen- - ciándose totalmente de las demás estructuras. La aplicación de esta técnica en el cerebro no es - recomendable, ya que los Cuerpos de Inclusión se tiñen del -- mismo color que el nucleolo, además el núcleo de la neurona - necrosada se observa también de color rojo, pudiendo dar lu-- gar a confusiones. Ofl(li'#A üt ~ CJft'i!r~

38 IV.- METODO DE SCHLEIFSTEIN " Método específico para la determinación de Cosp~sculos de Negri. Para poder realizar esta prueba nos vimos en la necesidad de colectar muestras de tejidos positivos fuera de la Facultad: Se obtuvieron ratones inoculados con el virus rá- - bico en los laboratorios Anchor, éstos presentaban la enferme dad en diferentes etapas y se tomaron para determinar la_presencia de Corp~sculos de Negri en las células nerviosas del - cerebro de acuerdo a la etapa o ciclo de la infección. A continuación, enumeraremos los resultados obtenidos en esta prueba: RATO N A B e D E *F CORPUSCULOS DE NEGRI POCOS POCOS ESCASOS ESCASOS ESCASOS ABUNDANTES OBSERVACIONES El animal presentaba incoordin~ ción intermitente,depresión,indiferencia y rechinido de los - dientes. Parálisis del tren posterior, - temblores,conjuntivitis, movi- mientos torpes y depresión. Parálisis gene~alizada,yace de lado con la cabeza tensa,disnea y reacción a los estímulos ex- ternos con ataques epilépticos. Animal en estado de coma. Muerto. Muerto. * Ratón inoculado con virus de campo.

39 Los Corpúsculos de Negri se observan de tamaño va-- riable y tienden a ser en su mayoría pequeños, varios se en-- cuentran en el centro del citoplasma y algunos en el borde de la membrana celular. Estos corpúsculos se tiñen de color rojo magenta y se diferencian totalmente del citoplasma, ya que é~ tos se tiñen de un color violáceo. De acuerdo aj porcentaje - de neuronas afectadas, se tomó como valor para determinar a - los Corpúsculos de Negri, escasos cuando es menos del 5% de - neuronas, pocos cuando es el 15 a 20 %, muchos 50 %, abundante cuando más del 80 % está afectado. También se observó que existían mayor número de Cor púsculos de Negri en ratones que se habían inoculado con el - virus del campo, que los que se habían inoculado con el virus del laboratorio, ésto debido a la modificación del virus.... as.,.,~

40 D I S C U S I O N La discusión de este trabajo experimental, consta sólo de un relato sobre los problemas a los que nos enfrentamos para lograr la estandarización de cada una de las técni- cas y de cómo se solucionaron los problemas. También enumeraremos la importancia de la aplica- - ción de estas técnicas, en base a las ventajas que ofrecen,en comparación de los métodos de laboratorio más usuales. Es frecuente tener fracasos al intentar realizar al gunas técnicas, aunque nos apeguemos a la metodología sugerida por el manual, ésto se debe en parte al grado de pureza - del material empleado, siendo el primer obstáculo para la obtención de buenos resultados. Hay que tomar en cuenta que cada tejido tiene sus variantes exclusivas ante los reactivos - empleados, por lo tanto el constante manejo de la técnica, el conocimiento y la acción de los reactivos es lo que va dando la pauta adecuada para cada método. Al realiz~r la técnica de Sudan IV, técnica específica para determinar Degeneración Grasa, fue necesario caro- - biar totalmente el procedimiento de la técnica que se había - descrito anteriormente debido a que los tejidos perdían cohe-

41 sión y se deslizaban fuera del portaobjeto cuando se le apli caba el etilenglicol, además de que existía poca absorción de Hematoxilina y la grasa se teñía pobremente. La técnica se cambio tornándose corno base otro tipo de metodología a la cual se le modificó los tiempos de exposición en la Hematoxilina a 15 minutos y en tinción de Sudan IV a 10 minutos. La estruct~ ra arquitectónica de las muestras positivas no se observan -- con detalle por el grosor del tejido, pero las grasas se ti-- ñieron a la perfección, indicándonos con ésto sin duda algun~ la degeneración. Para la identificación de la Degeneración Grasa no existe ningún otro método más que la aplicación de un estudio Histopatológico, siendo la técnica de Sudan IV la más práctica ya que el resultado se obtiene en un tiempo mínimo de 2 ho ras. En el Método Metacrornático de Kelly, el color rojo a violáceo dado por el colorante Azul de Touluidina no fue to rnado por los hongos, por lo que se aumentó el tiempo de exposición en la tinción de 5 a 8 minutos. Los resultados que se obtuvieron con la aplicación del Método Metacrornático de Kelly, nos representa en sí pecificidad de la técnica, asimismo nos indica la forma y

42 calización de las estructuras rnicóticas, mas no nos identifi-.:; ca en forma concreta al tipo de hongo que se trata. Es por lo consiguiente que recomendarnos la aplicación del Cultivo de Sabouraud el cual nos especificará el tipo del hongo en base a la observación de sus características morfológicas durante su desarrollo y en un intervalo de tiempo de 6 a 30 días de-- pendiendo del hongo actuante. El tiempo que se estableció para la determinación - del hongo, por medio de la utilización de esta técnica de tiq ción fue de 32 horas, después de la recolección del tejido -- sospechoso. En el Método de Shorr y Hematoxilina, el tiempo para lograr una buena penetración del colorante de Shorr es de 3 minutos, 2 minutos más de lo establecido,asimisrno se suplió el agua amoniacal por otro tipo de solución alcalinizante, - corno es el carbonato de litio, esto debido a que no se pudo - obtener el material propuesto para esta solución. El examen Histopatológico en el cual se incluya el Método de Shorr y Hematoxilina, no poseé la sensibilidad del aislamiento vírico, pero la identificación de los cuerpos de inclusión pueden ser útiles en el diagnóstico diata para el Médico Veterinario; aunque ésto Jfl(.lf\;p, üt ''~1AI f:l~~r~

43 ya que los cuerpos de inclusión son representativos de cierta etapa de la enfermedad, por lo cual la afección que se preteg de diagnosticar puede resultar en dado caso negativa (13).Los resultados se obtienen en un tiempo mínimo de 36 horas con la aplicación de esta técnica. En la aplicación de la técnica de Schleifstein,al - fijador se le cambió el bicloruro de mercurio por cloruro de mercurio sin que esto presentara algún cambio. Fue necesario también de exponer las laminillas antes de teñirse en una solución Iodada durante 10 min., con el fin de retirar los cri~ tales de mercurio y después en una solución de hiposulfito de sodio para retirar los cristales de Iodo. También fue necesario colocar las laminillas en un recipiente, se cubrió ampli~ mente con la tinción y se colocaron dentro de la estufa bacte riológica a una temperatura de 80 C con un tiempo de 15 min., ésto con el fin de suplir la parrilla eléctrica, que se debería utilizar para poder calentar la solución. Para la determinación de Corpúsculos de Negri con - la técnica de Schleifstein se lleva un término de 38 hrs., é~ ta técnica no es la más exacta ya que Schleifstein, hizo una modificación de la técnica de Seller (3), por lo un 80% de especificidad; pero ésto depende de la

44 Cospúsculos de Negri, ya que no todos los animales muertos por una infección rábic~ los presentan, no sustituyen a la técnica de Inmunofluorescencia, ni a la inoculación de animales que son métodos más específicos; pero, sí se puede tomar en cuenta para reafirmar algún resultado que haya quedado en duda (13). Ya que los Corpúsculos de Negri son cuerpos de in-- clusión virales, pensamos que la aplicación de esta técnica a órganos sospechosos de enfermedades virales que produzcan - - Cuerpos de Inclusión nos daría buenos resultados; pero los t~ jidos que se pudieron a prueba resultaron totalmente negati-- vos, probando con ésto que la técnica de Schleifstein es esp~ cífica para cuerpos de Inclusión acidofílicos característicos de la Rabia y no es útil para otras enfermedades (22). Ofl0f\i0 Cí.'.i: ~ cc~~c~x

45 e O N e L U S I O N E S 1.- Se logró la completa estandarización de las cuatro técnicas de tinción propuestas. Las técnicas que se estandarizaron son: A).- METODO DE SUDAN IV.- Técnica de tinción parala determinación de grasas neutras. B).- METODO METACROMATieO DE KELLY.- Técnica de tin ción específica para hongos. e>.- METODO DE SHORR Y HEMATOXILINA.- Técnica de tinción para la determinación de Cuerpos de In clución. D).- METODO DE SeHLEIFSTEIN.- Técnica específica pa ra la determinación de corpúsculos de Negri. 2.- Se reafirmaron los diagnósticos dados por este y otros d~ partamentos de la misma Facultad, asimismo los de otras - Instituciones. 3.- Se comprobó que el uso de otras técnicas de tinción en -- los diagnósticos histopatológicos, nos auxilian para la - obtención de buenos resultados. 1Hur;r. ot.,._",: 11~ ;;IJ:.. r\fd

46 S U M A R I O Se utilizaron muestras de tejidos de diferentes órganos afectados por enfermedades que causan Degeneración Grasa, Micosis y Cuerpos de Inclusión virales. Se estandarizaron cuatro diferentes técnicas de tig ción para lograr un diagnóstico definitivo más certero, así - como una mejor.enseñanza práctica de la Histopatología. Lastécnicas estandarizadas fueron: Técnica de Sudán IV, Técnica Específica para la determinación de grasas neutras (Degeneración Grasa), Método Metacromático de Kelly, Técnica de Tin-- ción específica para hongos, Método de Shorr y Hematoxilina, Técnica de Tinción para la determinación de Cuerpos de Inclusión Virales y la Técnica de Schleifstein, método especial p~ ra la determinación de Corpúsculos de Negri. Jt4:. ;' ',. 1 t... ~..... ~.~-r:::

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